Клиентам

Услуги

Сотрудничество

Фрагментный анализ ДНК


В связи с запуском нового 24-капиллярного секвенатора 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) мы объявляем о возможности проведения на базе ЦКП «ГЕНОМ» срочного фрагментного анализа ДНК (медицинская диагностика, анализ микросателлитов, определение отцовства, определение пород с/х животных и сортов растений и др.). Получение результатов возможно уже в течение дня доставки, возможная длина фрагментов ДНК – до 800 п.н.
Стоимость анализа одного образца составляет 170 руб.

Убедительно просим согласовывать детали заказов на проведение фрагментного анализа и сроки исполнения с сотрудниками ЦКП по телефону (499)135-97-19.

Фрагментный анализ и сиквенс – в чём разница?

Фрагментный анализ включает:
• Меченье фрагментов флуоресцентными красителями. В одном образце могут присутствовать флуоресцентные красители разных цветов. Кроме того, в каждом образце обязательно должен присутствовать стандарт длины (size standard), меченный красителем цвета, который не использовали для меченья продуктов. Стандарт длины нужен для определения длин фрагментов ДНК методом экстраполяции.
• Амплификацию меченных фрагментов методом ПЦР.
• Разделение фрагментов в секвенаторе методом капиллярного электрофореза.
• Анализ результатов в специальных программах (определение размера фрагментов, определение генотипов на основании соотношения различных аллелей анализируемых маркеров).

Рисунок 1. Фрагментный анализ разделяет флуоресцентно-меченные фрагменты разделены и определяет их длины.

 

Секвенирование – это определение последовательности пар нуклеотидов во фрагменте ДНК путём создания последовательности ПЦР-продуктов различной длины, выстроенных по длине.

Рисунок 2. Секвенирование разделяет флуоресцентно-меченные нуклеотиды и определяет расстояния между пиками.

Что можно изучать с помощью фрагментного анализа?

• Анализ микросателлитов (Microsatellite analysis).
Микросателлитные маркеры (локусы), также известные как короткие тандемные повторы, обычно амплифицируют с использованием флуоресцентно-меченного прямого и немеченного обратного праймеров. ПЦР-ампликоны разделяются по размеру при помощи электрофореза
Применение:
Linkagemapping
– Animal breeding
– Human, animal, and plant typing
– Pathogen sub?typing
– Genetic diversity
– Microsatellite instability
– Loss of Heterozygosity (LOH)
– Inter?simple sequence repeat (ISSR)
– Multilocus Variant Analysis (MLVA)

Генотипирование с использованием полиморфизма одиночных нуклеотидов (SNP Genotyping)
Маркер для определения полиморфизма одиночных нуклеотидов (SNP) состоит из отдельных пар оснований, варьирующих в известной последовательности ДНК, так, что формируется до 4 вариантов (аллелей) данного маркера.
Применение:
SNaPshot

• Фингерпринтинг (Fingerprinting)
Несколько технологий на основании AFLP используют полиморфизм длин фрагментов, полученных путем ферментативной рестрикции и ПЦР для создания уникального для каждого образца профиля (фингерпринта), позволяющего различать разные образцы ДНК.
Применение:
– Microbial genome typing
– Animal or plant genome typing
– Creation of genetic maps of new species
– Genetic diversity and molecular phylogeny studies
– Establishment of linkage groups among crosses

• Относительная флуоресценция (Relative Fluorescence)
Данный подход сравнивает высоту пиков или или расстояние между двумя образцами. Используются техники количественного ПЦР.
Применение:
LOHintumorsamples
CopyNumberVariation (CNV)
Aneuploidydetection

Планирование эксперимента

• Определите, какие маркеры (локусы) вы исследуете.
• На основании литературы и своих данных определите, какое ожидается распределение длин аллелей. Перекрываются ли фрагменты по длинам?
• Какой метод меченья будет использован (меченье 5'-конца прямого праймера или же встраивание флуоресцентно-меченных оснований)?
• Определитесь, желаете ли вы анализировать одновременно один продукт на реакцию (singleplex) или же несколько (multiplex)?
• Определите набор красителей (dye set), который подходит для вашего исследования.
• Определите стандарт длины (size standard), который подойдет для разброса длин ваших фрагментов и цвет его красителя.

Рекомендации по подготовке образцов на фрагментный анализ

1. Определите диапазон возможных длин анализируемых фрагментов ДНК, от этого зависит выбор стандарта длины (size standard), который обязательно добавляют в пробу.
2. Для того, чтобы увидеть продукт на фрагментном анализе, они должны нести флуоресцентные метки.
Наиболее часто используют методики типа микросателлитного анализа, в этом случае прямой ПЦР-праймер должен нести флуоресцентную метку на 5`-конце. Краситель следует выбрать из списка поддерживаемых наборов красок (загрузить таблицу). Мы работаем с четырёхкрасочным набором DS-30 или с пятикрасочным набором DS-33. Наиболее распространён пятикрасочный набор, в котором в качестве красителя для праймера используется Rox (красный), а в качестве стандарта длины Liz600(оранжевый).
Возможен одновременный анализ нескольких генов в одной лунке, в этом случае эти гены должны нести флуоресцентные метки разных цветов из одного набора (DS-30 или DS-33), либо же не перекрываться по длинам (так называемый мультиплекс). Мультиплексную систему сначала следует аккуратно отрабатывать, однако после отработки такой подход позволяет сэкономить время и деньги. Например, разгонять несколько микросателлитных локусов от одной особи в одной лунке.
3. Количество вносимой матрицы должно быть небольшим (не более, чем при подготовке к сиквенсу), чтобы своим свечением анализируемые фрагменты не заглушили свечение стандарта длины. После определения концентрации, полезно сделать несколько кратных разведений.
При завышенной концентрации за дополнительную оплату возможен повторный анализ с разведением, согласованным с заказчиком.
4. Пробы могут быть приняты к исполнению в пробирках 0.5 мл полностью собранными и упаренными (матрица, праймер и стандарт длины) или же охлажденными/замороженными. 
5. Для просмотра результатов фрагментного анализа разработано множество программ.
Мы используем программу GeneMarker http://www.softgenetics.com/GeneMarker.html
Для анализа больших сложных мультилокусных систем (например, определение личности человека или отцовства) существует программа GeneMapper (Applied Biosystems). Бесплатную облегченную версию данной программы Peak Scanner можно скачать у нас на сайте здесь.

Очистка образцов для фрагментного анализа.
Для очистки образцов можно использовать коммерческие колонки ProbeQuant G-50 Micro Columns  фирмы GE Healthcare (№ 28-9034-08), или альтернативные. При очистке следовать инструкции к колонкам.
При самомстоятельном приготовлении смолы для очистки:

  1. Приготовить 50% суспензию смолы Sephadex G50 Medium в однократном TE буфере.
  2. В многоразовые колонки налить по 250-300 мкл 50% смолы, центрифугировать 1 минуту при 0.8 rpm.
  3. Нанести образец, снова центрифугировать 1 минуту при 0.8 rpm.
  4. Все, что прошло через колонку – и есть очищенный материал.
  5. Образец либо высушить и растворить в формамиде, либо переосадить и растворить в формамиде.